一、柱體積的計算

我們在一些沖洗方法的資料中，經常會看到10倍柱體積或者20倍柱體積的說法。那么柱體積應該如何計算呢？我們可以把色譜柱想象為一個圓柱形，因此可以參考圓柱形計算公式。

V=πr²L

V=色譜柱體積(mL)  r=色譜柱半徑(cm)  L= 色譜柱長度(cm)

常規(guī)250*4.6mm的規(guī)格，柱體積經計算為4.15mL，以1mL/min的流速10倍柱體積就是42min左右。以下是一些常見規(guī)格的柱體積值，可作為參考。

二、Kromasil反相C18柱的沖洗

反相C18柱是我們日常實驗中應用廣泛的固定相之一，首先我們先從反相C18柱的常見情況沖洗進行介紹，分別是：一般污染的沖洗、使用緩沖鹽后的沖洗、生物樣品分析后的沖洗。

1、一般污染的沖洗

一般污染是指的是我們每次分析使用后常見的污染情況，例如試劑和樣品雜質對色譜柱產生的污染，或者是一些聚合物的形成等。

①   高比例的水相（例如：10%甲醇/乙腈-水溶液）沖洗10倍柱體積。這樣可以將殘留在色譜柱中的緩沖鹽和一些極性化合物沖洗干凈；

②   高比例的有機相（例如：80%甲醇/乙腈-水溶液）沖洗10-20倍柱體積。高比例有機相可以將一些疏水性的雜質沖洗干凈；

③   如果執(zhí)行上述沖洗之后還是污染問題沒有被解決，可以選擇異丙醇沖洗10-20倍柱體積。

2、使用緩沖鹽后的沖洗

流動相中時常會加入一些緩沖鹽，這些緩沖鹽可能會在色譜柱中析出，導致柱壓升高等問題，影響后續(xù)使用。

①   開啟柱溫箱，高比例的水相（例如：10%甲醇/乙腈-水溶液）沖洗20倍柱體積；

②   以未加入緩沖鹽的方法起始比例流動相進行平衡。

3、生物樣品污染

生物分析實驗中，通常前處理較為復雜，導致樣品無法處理干凈。可能會殘留小分子肽等物質，其會吸附在色譜柱的管壁或者篩板上，造成柱壓高、峰型差、分離度降低等問題。

①   在流動相的有機相中加入0.1%的三氯乙酸，以增強對吸附蛋白質的洗脫；

②   如果問題仍未解決，可嘗試在色譜柱里面進100uL三氮乙醇，嘗試清洗強保留的蛋白

三、Kromasil色譜柱沖洗指南

關于其他常見色譜柱的沖洗方法，可按照以下提示進行嘗試，若使用其他品牌的色譜柱請和廠商工程師確認后進行參考。

1、反相柱的沖洗

使用10倍柱體積的如下溶劑依次清洗

①   90%水-乙睛溶液

②   100%*

③   95%乙腈-水溶液

④   不含鹽的初始比例流動相

⑤   初始比例流動相平衡

2、正相柱的沖洗-硅膠柱

使用10倍柱體積的如下溶劑依次清洗

①   異丙醇

②   甲醇

③   乙酸乙酯

④   流動相

3、正相柱的沖洗-氰基柱、二元醇基柱

使用10倍柱體積的如下溶劑依次清洗

①   三氯甲烷

②   異丙醇

③   二氯甲烷

④   流動相

色譜柱污染在日常分析中在所難免，因此可以考慮購買Kromasil保護柱來進行預防。Kromasil保護柱采用分析柱相同填料填充，不增加死體積與不改變分離的同時，可以有效保護分析柱，延長使用壽命。